呋虫胺 (dinotefuran) (图式1)，化学名称为 1-甲基-2-硝基-3-(四氢-3-呋喃甲基) 胍，是日本三井化学公司研发的第三代烟碱类杀虫剂，主要作用于昆虫的乙酰胆碱受体，阻断昆虫正常的神经传导[1]。该药具有优良的内吸性，具备高效和速效的杀虫活性，广泛用于防治水稻、蔬菜和果树上的刺吸性半翅目、鳞翅目和双翅目等害虫。目前，呋虫胺在我国水稻和黄瓜作物上已登记，但尚未制定其最大残留限量 (MRL) 标准。日本、CAC及欧盟规定水稻(糙米)中呋虫胺的 MRL 值分别为 2、8 和 8 mg/kg，同时，日本将其在玉米、大豆、番茄和甘蓝中 MRL 值分别规定为 0.1、0.1、0.2 和 2mg/kg，CAC 规定其在芸薹属蔬菜、棉籽和葡萄中的 MRL 值分别为 2、0.2 和 0.9 mg/kg，欧盟规定其在芹菜和桃中的 MRL 值分别为 0.6 和0.8 mg/kg [2, 3, 4]。
图式 1
Scheme 1
图式 1 呋虫胺
Scheme 1 dinotefuran
呋虫胺在大米[5]、蔬菜[6]和棉花[7]等基质中的残留检测方法主要是高效液相色谱法 (HPLC) 和高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS)[8]，但针对呋虫胺在水稻中的残留行为以及膳食暴露风险评估报道较少[9]。本研究建立了呋虫胺在水稻糙米、稻壳和植株中的高效液相色谱分析方法，并基于此方法研究了呋虫胺在水稻植株中的残留消解动态，对安徽、广西和重庆 2012 和 2013 年的最终残留结果进行了膳食暴露风险评估，以期为制定我国水稻中呋虫胺的合理使用准则及其 MRL 标准提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
99% 呋虫胺 (dinotefuran) 标准品，德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；25% 呋虫胺可湿性粉剂 (dinotefuran，250WP)，江苏省东台市东南化工有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
Agilent 1200 液相色谱仪，配紫外检测器，安捷伦 (中国) 有限公司；RE-52CS 旋转浓缩蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；N-EVAP24 氮吹仪，美国 Organomation 仪器有限公司；Y-4 水浴恒温振荡器，江苏金坛金城国胜试验仪器厂。
1.2 分析方法
1.2.1 样品提取
植株和稻壳：样品切碎、混匀，称取10 g (精确到 0.01 g) 至具塞三角瓶中，加入 10 mL 水、50 mL 乙腈，振荡 30 min，过滤；加入 5 g 氯化钠 (过饱和) 剧烈振摇，静置 10 min；收集上清液，于 45 ℃ 下减压浓缩至近干，氮气吹干，定容到 2 mL，待净化。
糙米：样品用食品加工机粉碎，称取 10 g (精确到 0.01 g) 至具塞三角瓶中，先加入 20 mL 水，浸泡 20 min，再加入 50 mL 乙腈，振荡 30 min，过滤；加入 10 g 氯化钠 (过饱和) 剧烈振摇，静置 10 min；收集上清液，于 45 ℃ 下减压浓缩至近干，氮气吹干，定容到 2 mL，待净化。
1.2.2 样品净化
玻璃层析柱 (1.0 cm × 30 cm) 从下到上依次装入少量脱脂棉、2 cm 高无水硫酸钠、4.0 g 弗罗里硅土 (100～200 目) 和 2 cm 高无水硫酸钠；预先用 10 mL 乙腈预淋并弃去淋洗液，取 2 mL 样品加入层析柱中，用 50 mL 乙腈淋洗；收集全部洗脱液，于 45 ℃ 下减压浓缩至近干，氮气吹干，用色谱纯甲醇定容至 5 mL，待测。
1.2.3 HPLC-UV 检测条件
Aglient HC-C18 色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱箱温度 35 ℃；流动相为 V (甲醇)︰V (水) = 25 : 75，流速 0.9mL/min；检测波长 270 nm，进样体积 10 μL。在此条件下，呋虫胺的保留时间为 6.2 min。
1.2.4 标准溶液的配制及标准曲线绘制
准确称取呋虫胺标准品 0.1 (精确到 0.001 g)，用甲醇溶解，配制成 1 000 mg/L 的标准储备液，再逐级稀释成质量浓度分别为 20 、10、5、1、0.5 和 0.1mg/L 的标准工作溶液，按 1.2.3 节的条件测定，外标法定量，以质量浓度 (x) 为横坐标，相应的峰面积 (y) 为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.5 添加回收试验
准确称取空白糙米、稻壳和植株样品，进行 0.05、0.5 和 2.0 mg/kg 3 个水平呋虫胺的添加回收试验，每浓度 5 次重复。按 1.2.1 至 1.2.3 节的方法及条件进行提取、净化和检测。计算平均回收率和相对标准偏差 (RSD)。
1.3 田间试验
田间试验分别于 2012 和 2013 年在安徽省繁昌县、广西南宁市和重庆市铜梁县进行。每处理 3个重复，每重复为 1 个小区，每小区面积不小于 30 m2。小区之间设保护行，同时设空白对照。供试药剂为 25% 呋虫胺可湿性粉剂，于稻飞虱初发期兑水喷雾，推荐施药次数 1～2 次，施药间隔期 7～10 d，施药剂量 (有效成分) 为 60～90 g/hm2。
1.3.1 消解动态试验
选择未施用过呋虫胺的水稻田，于水稻分蘖期喷雾施药，施药剂量为有效成分 135 g/hm2 (推荐高剂量的 1.5 倍)。于施药后 2h 和 1、3、5 、7、14、21、30 d 分别采集植株样品。随机采集土表以上的全株 1 kg，剪成 1 cm 左右的小段，混匀后四分法缩分，于 -20 ℃ 贮存，待测。
1.3.2 最终残留试验
设 2 个施药剂量，分别为有效成分 90 g/hm2 (推荐高剂量) 和 135 g/hm2 (推荐高剂量的 1.5 倍)，施药次数为 2 次、3 次，施药间隔期为 7 d，首次施药时期为水稻收获前 35 d (根据采收间隔 7、14 和 21 d、施药间隔 7 d 和施药次数 2、3 次倒推得出)，分别于距最后一次施药后 7、14 和 21 d 采收水稻稻穗样品。随机剪取稻穗 3kg，晾干、脱壳、混匀后四分法缩分，于 -20 ℃ 贮存，待测。
1.4 膳食摄入风险评估
膳食暴露风险按公式 (1) 和 (2) 计算：
式 (1) 中：NEDI (national estimated daily intake) 为国家估计每日摄入量，μg/(kg bw·d)；STMRi (supervised trials median residue) 指第 i 级农产品的规范试验残留中值，mg/kg，Fi (food intake) 为不同人群对第 i 级农产品的膳食消费量[10]。
式 (2) 中：RQ (risk quotient) 为风险商，ADI (acceptable daily intake) 为每千克体重的农药日允许摄入量，mg/kg bw，呋虫胺的 ADI 为 0.2 mg/kg bw。当 RQ ≤ 1 时，表示其风险可以接受，RQ 越小，风险越小；当 RQ > 1 时，表示有不可接受的慢性风险，RQ 越大，风险越大[10]。
2 结果与分析
2.1 标准曲线和方法灵敏度
结果表明：在 0.1～20 mg/L 范围内，呋虫胺的峰面积 (y) 与质量浓度 (x) 间具有良好的线性相关性，线性回归方程为：y = 278.07x + 70.083，r = 0.995 7。检出限 (LOD) 为 0.01 ng。
2.2 方法的准确度和精密度
添加回收试验结果 (表 1) 显示：在 0.05～ 2mg/kg 添加水平下，呋虫胺在糙米、稻壳和植株中平均回收率在 70%～100% 之间，RSD 在 0.5%～6.5% 之间，方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求[11]。由最低添加水平得到呋虫胺在糙米、稻壳、植株中的定量限 (LOQ) 均为 0.05 mg/kg。典型色谱图如图 1 所示。
表 1
(Table 1)
表 1 呋虫胺在不同基质中的平均添加回收率及相对标准偏差 (n = 5)
Table 1 The recoveries and RSDs of dinotefuran in different samples at different levels (n = 5)
样品Samples
添加水平Fortified level/(mg/kg)
平均回收率Average recovery/%
相对标准偏差RSD
糙米Rice
0.05
100
3.5
0.5
83
2.9
2
81
1.8
稻壳Rice hull
0.05
89
3.4
0.5
83
2.4
2
76
0.5
植株Rice straw
0.05
85
6.5
0.5
84
2.6
2
70
1.5
表 1 呋虫胺在不同基质中的平均添加回收率及相对标准偏差 (n = 5)
Table 1 The recoveries and RSDs of dinotefuran in different samples at different levels (n = 5)
图 1
Fig. 1
图 1 呋虫胺标准品和样品色谱图
Fig. 1 Chromatogram of dinotefuran standard and difference samples of rice grain and rice
2.3 呋虫胺在水稻植株中的消解动态
结果 (表 2) 表明：呋虫胺在水稻植株中的消解动态曲线符合一级反应动力学方程，消解半衰期为 2.3～4.8 d，消解速率较快，药后 7 d 的消解率大于 90%；两年三地的消解趋势基本一致。
表 2
(Table 2)
表 2 呋虫胺在水稻植株中的消解动态
Table 2 Dissipation of dinotefuran in rice grain
地点Location
年份Year
消解动态方程Dissipation equation
相关系数Correlation coefficient，r
半衰期Half-life/d
安徽Anhui
2012
ct = 1.711 6e-0.296 6t
-0.895 8
2.3
2013
ct = 1.341 4e-0.157 2t
-0.903 3
4.4
重庆Chongqing
2012
ct = 0.782 3e-0.215 5t
-0.910 7
3.2
2013
ct = 2.023 7e-0.222 2t
-0.913 2
3.4
广西Guangxi
2012
ct = 1.352 2e-0.144 1t
-0.956 8
4.8
2013
ct = 2.193 4e-0.261 3t
-0.966 6
2.6
表 2 呋虫胺在水稻植株中的消解动态
Table 2 Dissipation of dinotefuran in rice grain
2.4 呋虫胺在糙米中的最终残留
两年三地的试验结果 (表 3) 表明：距最后一次施药后 7 d，糙米中呋虫胺的残留量为 <0.05～0.53 mg/kg，14 d 为 < 0.05～0.25 mg/kg，21 d为 <0.05～0.12 mg/kg，其残留量随时间延长而降低，间隔 7 d 的残留中值 (STMR) 为 0.10 mg/kg。
表 3
(Table 3)
表 3 呋虫胺在糙米中的最终残留量
Table 3 The terminal residues of dinotefuran in rice
试验地点Location
施药剂量 (有效成分)Dosage，a.i/(g/hm2)
施药次数Times
采样间隔期Harvest interval/d
残留量 Residue/(mg/kg)
2012
2013
安徽Anhui
90
2
7
0.26
0.06
14
0.18
<0.05
21
<0.05
<0.05
3
7
0.31
0.09
14
0.20
<0.05
21
<0.05
<0.05
135
2
7
0.34
0.10
14
0.24
<0.05
21
0.10
<0.05
3
7
0.53
0.11
14
0.25
<0.05
21
0.12
<0.05
重庆Chongqing
90
2
7
<0.05
0.06
14
<0.05
<0.05
21
<0.05
<0.05
3
7
<0.05
0.06
14
<0.05
<0.05
21
<0.05
<0.05
135
2
7
<0.05
0.09
14
<0.05
<0.05
21
<0.05
<0.05
3
7
<0.05
0.09
14
<0.05
0.07
21
<0.05
<0.05
广西Guangxi
90
2
7
0.06
0.10
14
<0.05
0.07
21
<0.05
<0.05
3
7
0.07
0.14
14
<0.05
0.07
21
<0.05
<0.05
135
2
7
0.08
0.26
14
<0.05
0.08
21
<0.05
<0.05
3
7
0.10
0.36
14
<0.05
0.10
21
<0.05
0.05
表 3 呋虫胺在糙米中的最终残留量
Table 3 The terminal residues of dinotefuran in rice
2.5 农药的膳食暴露量和风险评估
农药的膳食暴露量和风险商值由农产品中最终残留试验结果、膳食摄入结构和摄入量、农药的ADI 值共同决定。不同国家、不同年龄人群的膳食结构差异明显，本研究以我国不同人群的膳食结构为基础[12]，糙米中距末次施药间隔 7 d 的最终残留试验中值 (STMR) 为 0.10 mg/kg，根据国际食品法典委员会的规定，呋虫胺的 ADI 值为 0.2mg/kg bw[13]，根据公式 (1) 和 (2) 计算估计暴露量和风险商值。呋虫胺已在我国水稻上获得正式登记，故本次评估围绕初级农产品糙米展开。我国不同人群 (年龄和性别) 中稻米的平均摄入量 (F)、国家估计每日摄入量 (NEDI) 和呋虫胺的风险商值 (RQ) 详见表 4。从表中可以看出：我国不同年龄段、不同性别人群中呋虫胺的风险商值为 0.002～0.005，远小于 1，表明其膳食暴露风险较低。
3 结论与讨论
本研究建立了呋虫胺在水稻糙米、稻壳和植株中的残留分析方法，样品采用乙腈和水提取，Florisil 柱层析净化，高效液相色谱-紫外检测器检测。根据呋虫胺强极性的特点，提取溶剂选择了乙腈；提取体系加少量水，更有利于去除杂质；采用 Florisil 填充柱净化，比使用通常规格 (500 mg，6 mL) 的固相萃取 (SPE) 小柱在净化容量上有增加，具有明显优势。该方法前处理简便，净化和检测条件优化后与杂质峰分离较好、目标峰附近无干扰，方法重现性好、灵敏度高，准确度和精密度均符合农药残留分析的要求。
2012、2013 两年安徽、重庆、广西 3 地的消解动态试验结果表明：呋虫胺在水稻植株中的消解速率较快，半衰期为 2.3～4.8 d。最终残留试验结果表明：25% 呋虫胺可湿性粉剂，分别以有效成分 90 和 135 g/hm2 的剂量施药 2～3 次，距末次施药后 7 d 收获的糙米中呋虫胺的最高残留量为 0.53 mg/kg，均远低于日本和 CAC 规定的呋虫胺在稻米中的最大残留限量 (MRL) 值 2 mg/kg 和 8mg/kg。
基于规范残留试验得到残留中值，进而对来源于初级水稻产品 (糙米) 上登记使用的呋虫胺的长期膳食摄入和风险评估结果显示，我国各类人群对呋虫胺国家估计每日摄入量 (NEDI) 为 0.438～1.087 μg/(kg bw·d)，风险商值 (RQ) 为 0.002～0.005，远小于 1，说明呋虫胺在糙米中的长期膳食摄入风险较低。该结果可为我国制定呋虫胺在糙米中的最大残留限量 (MRL) 标准提供有效参考。
本研究数据来源于典型水稻种植地区两年 3 地的试验结果，在评估数据范围上还有待增加。针对不同年份、不同生态环境及生产方式下呋虫胺在水稻上登记产品的残留试验正在持续进行中。同时，呋虫胺在我国的其他作物如棉花和茶叶中的登记也正在进行。本研究仅考虑了糙米对我国居民健康状况的影响，对蔬菜、茶叶和经济作物等的评价尚未涉及。因此，随着呋虫胺在中国登记范围的逐步扩大，还需进一步确定其在其他食物种类如蔬菜、油料等的膳食摄入风险，完善评估范围，为评估制定呋虫胺的残留限量标准 (MRL) 提供更全面的依据。